| Описание: |
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) — один из наиболее эффективных и широко распространенных в настоящее время методов фракционирования и очистки белков. Его используют как на завершающих стадиях эксперимента (аналитический вариант), так и при обработке исходного клеточного гомогена-та (препаративный вариант). Многие методические приемы, например приготовление гелей полиакриламида и агарозы, окраска белковых полос, элюция белков из гелей и др., роднят ИЭФ с электрофорезом белков, подробно рассмотренным в предыдущей книге [Остерман, 1981]. Фракционирование белков при ИЭФ производится в электрическом поле с помощью тех же приборов, которые используются для электрофореза. Ниже при изложении материала предполагается, что читатель уже знаком с этими методами и аппаратурой.
Вместе с тем между электрофорезом и ИЭФ существуют важные различия, поскольку фракционирование белков при ИЭФ идет по совсем иному принципу. В процессе электрофоре-ш за белки разделяются вследствие различия скоростей их миграции в электрическом поле, которые обусловлены суммарными электрическими зарядами белков в среде с неизменным рН и их размерами, определяющими степень торможения белков о сетку геля. При ИЭФ параметром фракционирования служит значение изоэлектрической точки (pi) белка как цвиттериона.
В первой главе подробно описан принцип метода ИЭФ, т.е. характер миграции белков под действием электрического поля в среде с изменяющейся вдоль пути этой миграции величиной рН («градиент рН»). Достаточно детально рассмотрен и способ образования градиента рН, в частности свойства «амфоли-тов» — веществ, формирующих этот градиент под действием электрического поля. Такое рассмотрение необходимо для понимания описанных ниже экспериментальных подходов и позволяет сразу же выявить некоторые уязвимые места метода, игнорирование которых может привести к артефактам. Вторая глава посвящена разбору аналитических вариантов ИЭФ, сгруппированных по типу используемых гелей: горизонтальные пластины полиакриламидного геля (ПААГ), вертикально стоящие трубки ПААГ и горизонтальные пластины агарозы. В отдельную главу выделен ^^вычайно плодотворный аналитический
3 |
